کلونینگ و بیان ترشحی ژن لیپاز (btl۲) باسیلوس ترموکاتنولاتوس در پیکیا پاستوریس با استفاده از توالیهای نشانه طبیعی و آلفا فاکتور مخمری

لیپاز (triacylglycerol acylhydrolase ec 3.1.1.3 )، هیدرولیز تری آسیل گلیسرول به گلیسرول و اسیدهای چرب را در حد فاصل لایه چربی و آب کاتالیز می کند. لیپازها در فرمولاسیون شوینده ها، تهیه بیوسورفکتانتها، صنایع روغن، غذایی، کشاورزی، چوب و کاغذ، پزشکی و دارویی کاربرد دارند. مهم ترین کاربرد این آنزیم در صنایع شوینده است. در این تحقیق، پس از استخراج dna ژنومی باکتری باسیلوس ترموکاتنولاتوس ) bacillus thermocatenulatus ( مولد لیپاز، ژن لیپاز btl2 (همراه با توالی نشانه و بدون توالی نشانه) با روش pcr تکثیر و در حامل بیانی ppic9 تحت کنترل پروموتر الکل اکسیداز کلون شد pyv128) و (pyv129 پس از تأیید صحت کلونینگ توسط pcr و برش آنزیمی، پلاسمیدهای نوترکیب فوق با آنزیم bgl ii خطی شده و با روش الکتروپوریشن به میزبان پیکیا پاستوریس (pichia pastories) انتقال داده شدند. مخمر پیکیا پاستوریس نوترکیب در محیط bmgy کشت داده شد و با متانول بیان آنزیم لیپاز القاء شد. وجود آنزیم در محیط کشت با آزمون پارانیتروفنیل پالمیتات (pnpp) و روش ایمونوبلات تأیید شد. خالص سازی لیپاز نوترکیب به روش تعویض یونی انجام و فعالیت ویژه آنزیم به روش ph- stat تعیین شد. نتایج تولید u/l 18000 لیپاز نوترکیب در کشت فلاسک و کسب u/l12000 آنزیم نوترکیب خالص (راندمان خالص سازی 66 درصد) با فعالیت ویژه /mgμ 5728 را نشان داد.